En 1985, luego de graduarse en Medicina, conoció a su colega Giuseppe Montesano (con quien después tendría un hijo, Mario), y de este encuentro surgió su decisión de especializarse en neuropsiquiatría en la clínica psiquiátrica de la Universidad de Roma. Así comenzó su curso de estudios como investigadora científica, enfocándose inicialmente en bacterias y enfermedades de los barrios más pobres de Roma, y después en enfermedades mentales.
Alrededor de 1900, comenzó a realizar investigaciones en el Asilo Psiquiátrico Romano de Sta. María della Pièta, que hospedaba a niños con discapacidades y trastornos de comportamiento en un estado de privación emocional grave. Montessori se dedicó a esos niños con amor y profunda atención, y pronto se dio cuenta que el método educativo utilizado en el asilo estaba mal adaptado a las necesidades y a las habilidades psicofísicas de los pequeños.
Como resultado, desarrolló un profundo interés en los niños con discapacidades mentales, recurriendo a las obras de Jean-Marc-Gaspard Itard y Edouard Séguin, que estaban entre sus más grandes fuentes de inspiración.
Mientras tanto, las luchas políticas por los derechos civiles y conquistas sociales se expandían alrededor del mundo. María Montessori comenzó a interesarse en la emancipación de la mujer y, en 1896, participó en el primer Congreso Internacional de Mujeres sobre los derechos de las mismas en Berlín.
A lo largo de su vida, continuó su lucha por los derechos de las mujeres, siempre colocándose por voluntad propia al frente de protestas y conferencias. El 31 de marzo de 1898, en secreto dio a luz a su hijo Mario, nacido de la relación con Montesano. Su relación se mantuvo en clandestinidad por largo tiempo, pues no era bien vista por la comunidad científica. En consecuencia, tuvo que entregar a su hijo a una casa cuna. Recuperó la custodia hasta 1913.
En septiembre de 1898, Montessori participó en el Congreso Pedagógico en Turín, donde dio una conferencia importante sobre la relación entre la medicina y la pedagogía, hablando por primera vez acerca de una educación especial dirigida a niños con problemas mentales, intentando así despertar el interés público sobre el tema, consiguiendo los resultados esperados.
